Летопись важнейших открытий

Установление структуры витамина В₁₂

1956 г. в истории химии ознаменовался крупным достижением: на основании рентгеноструктурного анализа и данных по химическому расщеплению впервые была установлена структура витамина В₁₂ – вещества, являющегося биологическим катализатором реакций, связанных с кроветворением.
То, что печень обладает лечебными свойствами, было известно уже в конце XIX в. В 1920-х гг. английские исследователи Р.Майнот и У.Марфи установили, что в печени содержится вещество неизвестной структуры, которое излечивает тяжелое заболевание – злокачественное малокровие, называемое пернициозной анемией. Вследствие того, что длительное употребление печени пациентами для лечебных целей вызывало стойкое к ней отвращение, в последующие годы были получены и предложены в качестве ее заменителей различные препараты, представлявшие собой концентраты биологически активных веществ из печени.
Впервые антипернициозное вещество печени было выделено в кристаллическом виде в 1948 г. независимо двумя группами исследователей: Е. Рикесом и К.Фолькерсом с сотрудниками и Е.Смитом. Именно Рикес и Фолькерс предложили для этого вещества название «витамин В₁₂».

Первые исследования состава и структуры

Исследованиями Смита было выяснено в общих чертах строение витамина В₁₂ – это внутреннее комплексное соединение кобальта, содержащее азот. В 1951 г. было установлено, что молекула В₁₂ содержит также цианогруппу. С тех пор за этим витамином закрепилось название «цианокобаламин».
Изучение строения витамина В₁₂ и его химического действия было сопряжено с большими трудностями в связи с тем, что его было крайне тяжело выделять из печени. Путем водноспиртовой экстракции, освобождения от белков, адсорбции, хроматографического разделения, распределения между двумя жидкими фазами и других операций из 1000 кг свежей печени ученым удавалось в то время выделить только несколько десятков миллиграммов этого вещества. Одновременно были разработаны другие методы получения витамина В₁₂, более дешевые¹, в частности использование ила сточных вод, подвергшегося гнилостным бактериальным процессам. Но наряду с цианокобаламином из него извлекали в значительном количестве неактивные псевдовитамины В₁₂ и другие сопутствующие продукты, от которых избавиться было очень трудно. В результате оказалось, что данный способ невозможно использовать для получения химически чистого препарата.
Все же медленно, но верно, используя как химические, так и физические методы исследования, ученые продвигались в направлении выяснения структурных особенностей этой молекулы.
Так, в начале 1950-х гг. независимыми исследованиями ряда американских и английских ученых было подтверждено, что в молекуле цианокобаламина атом кобальта связан комплексно, а не как ион. Это следовало из того обстоятельства, что при энергичном щелочном гидролизе данного кобальтсодержащего комплекса кобальт из него отщепить не удавалось. Было также установлено, что кобальт обладает координационным числом 6 и имеет валентность либо 2, либо 3. В некоторых частях структуры наблюдалось сходство с молекулой витамина В₂ (рибофлавина) – наличие конденсированной системы 3,4-диметил-o-фенилендиамина.
В результате к 1953 г. оказалось возможным воспроизвести в общих чертах лишь фрагмент молекулы, в котором атом кобальта был включен в тетрапиррольное ядро коррина (рис. 1). Одновременно стало известно, что в состав молекулы входят фосфорная кислота, D-рибоза и 5,6-диметилбензимидазол. О характере связи центрального фрагмента с остальными частями молекулы высказывались самые разнообразные предположения.

Деятельность Д.Ходжкин
по установлению
структуры витамина В₁₂

В годы второй мировой войны одной из остро вставших проблем на научном фронте оказалась проблема пенициллина. В военное время в этом лекарстве возникла самая острая потребность для лечения инфекционных заболеваний. Но поскольку химическая структура пенициллина была почти неизвестна, не могло быть и речи о его синтезе и налаживании массового производства. Усилия лабораторий многих стран были направлены на решение этой проблемы.
Располагая небольшой группой помощников в Оксфорде, английская исследовательница Дороти Ходжкин в 1942 г. также включилась в общую волну исследований в этом направлении. К тому времени ученая уже сумела хорошо себя зарекомендовать в качестве опытного кристаллографа и специалиста в области рентгеноструктурного анализа (РСА) белков, поэтому Эрнст Б.Чейн, разработавший способ выделения и очистки этого антибиотика, решил предоставить ей столь драгоценные в то время кристаллы этого вещества для исследований.
Усиленная работа в этом направлении в течение последующих 6 лет и одновременное совершенствование расчетных методик и техники РСА привели Ходжкин и ее коллег к успеху. В 1949 г. она окончательно определила молекулярную структуру пенициллина.
Еще до окончания работы над пенициллином, в 1948 г., сразу же после того, как были получены первые кристаллы витамина В₁₂, Ходжкин обратилась к изучению структуры этого вещества с помощью метода РСА. Уже первые рентгенограммы показали, что определение структуры в данном случае является практически невыполнимым заданием. Аналогичные структуры ранее исследователям не встречались. Молекулярная масса этого соединения (1355)² превышала массы всех ранее известных структур.

Следует заметить, что 1930–1940-е гг. – это начальный период в развитии рентгеноструктурных исследований сложных органических молекул. В те давние времена каждая новая рентгенограмма вызывала большое волнение и дискуссии. Исключительно трудную задачу представлял анализ даже малых молекул, состоящих из нескольких атомов. Нужно было обладать фантастической прозорливостью, чтобы уметь расшифровывать рентгенограммы сложных молекулярных структур.
Дело в том, что проблема рентгеноструктурного анализа любого кристалла состоит в нахождении не только амплитуд всех дифрагированных лучей (обычно называемых отражениями), но и их фаз. Знание амплитуд и фаз позволяет кристаллографу воспроизвести распределение электронной плотности кристалла, которое создает набор дифрагированных лучей, и в конечном итоге на основании интерпретации карт электронной плотности получить информацию о структуре вещества. Амплитуды находят по интенсивности дифрагированных лучей. Однако наличие в молекуле большого числа атомов приводит к необходимости очень большого числа дифракционных измерений. Это трудоемкий процесс, и он отнимает много времени. Кроме того, интенсивности дифрагированных лучей относительно слабы по сравнению с интенсивностями отражений для кристаллов малых молекул. Эти трудности приводят ко многим дополнительным техническим проблемам. Достаточно сложной является в этих исследованиях и так называемая «фазовая проблема». Со всеми этими трудностями в свое время столкнулась Ходжкин.

Рис. 1. Коррин

К счастью, уже на пенициллине ею были созданы многие способы обработки данных, развиты косвенные методики расчетов и корректировки данных. Именно на пенициллине она одной из первых использовала вычислительную технику для этих целей. Ходжкин в значительной степени усовершенствовала методику расчета фаз на основе так называемого метода изоморфного замещения³.
С 1948 г. в течение всех последующих шести лет Ходжкин тесно сотрудничала с химиками-органиками, которые занимались той же проблемой, но с использованием химических методов исследования. В каждом из этих случаев рентгеновское и химическое исследование взаимно дополняли друг друга.
Совместные усилия вскоре привели к значительным успехам. Ходжкин смогла установить отдельные структурные фрагменты молекулы. Особенно важной совместной работой стало установление структуры гексакарбоновой кислоты в 1953 г. В то время ее коллеги (Дж.Кэннон, А.Джонсон и А.Тодд) в химической лаборатории Кембриджского университета выделили из гидролизата цианокобаламина методом электрофореза на бумаге кристаллическую оптически активную кобальтсодержащую гексакарбоновую кислоту, которая при расщеплении давала производные пиррола и алифатические органические кислоты различного строения. Тогда Ходжкин с сотрудниками произвела рентгеноструктурный анализ этой кислоты, используя новейшие методики обработки данных с помощью компьютера. Оказалось, что гексакарбоновая кислота содержит новую, частично гидрированную тетрапиррольную циклическую систему с пятью сопряженными двойными связями.
С помощью этого анализа структура В₁₂ впервые была интерпретирована как клешнеобразный (хелатный) кобальтовый комплекс. Предполагалось, что в комплекс входит эфир остатка фосфорной кислоты 5,6-диметилбензимидазолнуклеотида с -аминопропиловым спиртом. Аминогруппа этого спирта образует пептидную связь с карбоновой кислотой, входящей в состав частично гидрированной тетрапиррольной циклической системы с пятью сопряженными связями. Атом кобальта в этом гипотетическом комплексе координационно связан с цианогруппой четырьмя атомами азота пиррольных колец и атомом азота в 3-положении бензимидазола.

Рис 2. Хлорофилл а (R=CH3)

Следует заметить, что подобные циклические пиррольные структуры были найдены в то время в различных природных системах. К ним относятся хлорофилл и цитогемин (клешнеобразные комплексные соединения тетрапиррольной циклической системы с магнием и железом соответственно) (рис. 2 и 3). Но тетрапиррольная циклическая система у витамина В₁₂, как оказалось, была построена несколько иначе.

Рис 3. Цитогемин (гем а)

Для уточнения структуры цианокобаламина понадобилось еще несколько лет экспериментов и расчетов. Окончательные детали пространственного распределения атомов в молекуле витамина В₁₂ (его полная трехмерная структура) были установлены в 1956 г. (рис. 4). В расчетной части Ходжкин оказало помощь Национальное бюро стандартов западных автоматических компьютеров в Лос-Анджелесе.

Рис 4. Структура витамина В12 (цианокобаламин, R=CN)

Молекула витамина В₁₂ состоит из трех частей. Планарная часть содержит тетрапиррольное ядро коррина, стабилизированное центральным атомом кобальта. Перпендикулярно к ней расположена нуклеотидная часть, построенная из циклических остатков рибозы и 5,6-диметилбензимидазола и замкнутая в макроцикл через карбоксамидный атом азота. Этот атом азота связан с одной стороны через остаток пропановой кислоты с тетрапиррольной группировкой, а с другой стороны – через изопропильный мостик – с кислородом группы и далее с фрагментами рибозы и бензимидазола. Анионная часть соединена с атомом кобальта необычной кобальт-углеродной связью (рис. 5).

Рис 5. Нобелевский лауреат Д.Ходжкин  демонстрирует структуру витамина В12 на модели

Определение структуры позволило выяснить механизм действия витамина В₁₂ в организме, а также спланировать первые эксперименты по модификации его молекулы с целью изменения физиологических свойств.
Через достаточно продолжительный период времени (об этом см. следующие номера газеты «Химия») его структура наконец-то была подтверждена синтетическим путем.
«За определение с помощью рентгеновских лучей структур биологически активных веществ», пенициллина и витамина B₁₂ Ходжкин в 1964 г. получила Нобелевскую премию по химии. При презентации член Шведской Королевской академии наук Гуннар Хегг сказал: «Знание структуры соединения является абсолютно необходимым для того, чтобы интерпретировать его свойства и реакции и решить, как можно его синтезировать из более простых соединений. При этом определение структуры пенициллина явилось поистине изумительным стартом новой эры кристаллографии... Определение же структуры витамина В₁₂ следует понимать как триумф рентгеноструктурного анализа кристаллов с точки зрения химической и биологической значимости результатов при огромной сложности структуры».

Литература

Jeffrey G.A. Nobel Prize Awarded to Crystallographer. Science, 1964, v. 146, p. 748–749;
Nobel Prize Given for Vitamin Studies. Chem. Eng. News, 1964, November 9, p. 54;
Кривобокова С.С. Дороти Кроуфот-Ходжкин. ЖВХО им. Д.И.Менделеева, 1975, № 6, с. 686–687.

* * *

ХОДЖКИН Дороти Мэри, урожденная Кроуфут (12.V.1910–29.VII.1994), родилась в Каире, в Египте. Ее отец, Джон Уинтер Кроуфут, был известным специалистом в области классической английской филологии и археологом Египетской службы образования. Детство Дороти Кроуфут прошло в Англии, Египте и Судане, где она восприняла от отца любовь к истории и археологии, а от матери – солидные ботанические знания.
Дороти, старшей из четырех дочерей Дж.Кроуфута, исполнилось 4 года, когда началась первая мировая война. Боясь возможного нападения со стороны турецкой армии, родители отправили детей в Англию к бабушке по линии отца в г. Уортинг, расположенный в нескольких милях от Брайтона, на берегу Ла-Манша. После прекращения военных действий в 1918 г. дети поселились вместе с матерью в г. Линкольне (Англия), где они получили первоначальное домашнее образование, а затем переехали вместе с ней в г. Гелдстоун. Отец в это время продолжал работать на Ближнем Востоке, поэтому матери приходилось регулярно оставлять детей на некоторое время без своей опеки.
До 1928 г. Дороти обучалась в школе сэра Джона Лимана (г. Биклес), где она неожиданно увлеклась кристаллографией и химией. Под влиянием коллеги отца А.Ф.Джозефа, химика-почвоведа, она занялась количественным анализом различных минералов. Джозеф научил девочку элементарным химическим операциям и снабжал ее необходимыми реактивами.
В 1925 г. мать Дороти подарила дочери книгу «О природе вещей», написанную специально для школьников известным кристаллографом и кристаллохимиком У.Г.Брэггом. Этот подарок подогрел интерес девушки к кристаллографии. Но ее влекла также и другая наука – археология.
В 1926 г. отец Дж.Кроуфут был назначен на пост директора Британской школы археологии г. Иерусалима. На каникулы девушка приезжала к родителям в Палестину. Она принимала участие в археологических экспедициях, раскапывая византийские храмы в Джераше (Трансиордания, ныне Иордания), совместно с коллегами отца делала зарисовки мозаик древних церквей. Но любовь к химии победила. Вернувшись в Англию после очередных каникул в 1928 г., Кроуфут поступила на химическое отделение в Соммервил-колледж при Оксфордском университете.
В первый год обучения она пыталась еще как-то совместить свои увлечения разными областями знаний. Все свободное время Дороти проводила над рисунками мозаик, присланных матерью из Палестины, и за химическими исследованиями образцов окрашенных стекол из этих мозаик. Ее научным руководителем в Соммервил-колледже был профессор Х.М.Поуэлл, который, видя необычайный интерес студентки к химическому анализу, всячески содействовал ей в исследованиях. В частности, он предоставил Кроуфут ключи от лаборатории в свободное пользование, чтобы она могла проводить там свои исследования независимо от времени лабораторных занятий, в том числе и в каникулы.
В конце 1920-х гг. лаборатория как раз была оснащена новыми приборами для рентгеновской кристаллографии и кристаллохимии. По воспоминаниям Поуэлла, это был первый случай в его практике, чтобы девушка была так увлечена химией. Надо сказать, что в то время во всем Оксфордском университете девушек было всего лишь 10%. Что касается естественных наук, то девушек, специализировавшихся в этой области, было еще меньше. Благодаря содействию Поуэлла Кроуфут смогла одно лето провести в лаборатории знаменитого кристаллографа Виктора Гольдшмидта в Гейдельберге (Германия).
В 1932 г. Кроуфут закончила обучение в колледже, получив степень бакалавра. Как раз в это время в Оксфорд приехал старый друг семьи Кроуфутов, упоминавшийся выше доктор Джозеф. Он случайно встретил знакомого профессора из Кэмбриджа Т.С.Лоури, который предложил попробовать молодой ученой поработать в лаборатории выдающегося физика-кристаллографа Дж.Д.Бернала, набиравшего в то время команду молодых исследователей под один из своих проектов в только что созданной им кристаллографической лаборатории. Дороти с воодушевлением приняла это предложение. Она получила небольшую исследовательскую стипендию для этой цели, которая вместе с дополнительной материальной помощью тети позволила ей провести два чрезвычайно насыщенных в научном плане года в Кэмбриджском университете. Проект Бернала касался рентгеноструктурных исследований производных стерола (твердых циклических спиртов, таких, как холестерин, обнаруженных в биологических тканях). Самостоятельной частью этой работы для молодой исследовательницы стало изучение кристаллов пепсина.
Вместе с Берналом Кроуфут добилась успеха на первом этапе исследований в области рентгеноструктурного анализа кристаллов глобулярных белков. В сущности, рентгеноструктурный анализ белков вообще стал возможен лишь после того, как им удалось в 1934 г. разработать метод анализа монокристаллов белка, погруженных в маточный раствор.
В 1934 г. работа в Кэмбридже была прервана. Кроуфут вернулась в Соммервил-колледж при Оксфордском университете на преподавательскую работу. Здесь она продолжила свои исследования в области стеролов, особенно йодида холестерина. К сожалению, оборудование, которым она здесь располагала, было достаточно скудным и устаревшим. Поэтому на протяжении еще многих последующих лет она неоднократно приезжала в командировки в Кэмбридж, чтобы осуществить некоторые измерения. Благодаря содействию Бернала ей было предоставлено небольшое помещение для исследований в лаборатории кристаллографии.
В 1937 г. Кроуфут защищает диссертацию на основе своих исследований по йодиду холестерина (она получает степень доктора философии). В том же году при поддержке профессора сэра Роберта Робинсона ей удается получить наконец небольшой грант на покупку необходимого оборудования для исследований, в том числе нового рентгеновского аппарата.
В том же 1937 г., находясь в Лондоне по делам, Кроуфут встретила Томаса Л.Ходжкина⁴, историка, обучавшегося в то время в Винчестере и Оксфорде, и вышла за него замуж. Супруги имели троих детей: Люка (1938), Элизабет (1941) и Тоби (1946).
В эти годы у Дороти Ходжкин возник интерес к изучению кристаллов инсулина (первый экземпляр был подарен ей профессором Робинсоном). В то время разрешающая способность метода была недостаточна, чтобы сделать какие-то заключения о строении молекулы, но ученой удалось получить новые интересные данные о молекулярной массе этого соединения, степени агрегирования молекулы и пр.
Работы Ходжкин по установлению строения пенициллина, а затем витамина В₁₂ являются вершиной классического этапа развития рентгеноструктурного анализа. Несколько позже ею была определена структура цефалоспорина С, также важнейшего антибиотика из семейства пенициллиновых. В 1972 г. после почти что сорока лет работы она закончила анализ цинк-инсулина. Работа над структурой этой сложной молекулы, которая содержит почти 800 атомов, была дополнительно осложнена тем, что инсулин кристаллизуется с образованием нескольких форм.
В 1946 г. Ходжкин получила звание доцента, а в 1960 г. – профессора Оксфордского университета.
Между 1960-м и 1977-м гг. Ходжкин занимала пост Вольфсоновского профессора-исследователя Лондонского Королевского общества. В 1977 г. ученая была избрана членом совета Вольфсон-колледжа в Оксфорде. Интересно, что за год до присуждения ей Нобелевской премии кузен ее мужа – Алан Ходжкин – также стал Нобелевским лауреатом (в области физиологии и медицины).
Дороти Ходжкин получила почетные ученые степени Кэмбриджского, Гарвардского и Броуновского университетов, а также университетов Лидса, Манчестера, Суссека, Чикаго и многих других. Она была второй женщиной в истории Англии, награжденной орденом «За заслуги» (1965). Ходжкин была избрана членом Лондонского Королевского общества (1947), а также иностранным членом ряда академий наук (Американской академии искусств и наук – 1958 г., Американской национальной академии наук – 1971 г., Академии наук СССР – 1976 г.); награждена Королевской медалью (1956) и медалью Копли (1976) Лондонского Королевского общества и золотой медалью им. Ломоносова АН СССР (1982).

Е.А.ЗАЙЦЕВА

¹Следует заметить, что все разработанные в 1950-е гг. микробиологические методы получения витамина В₁₂ все равно отличались относительной дороговизной: 245 тыс. долларов США за 1 кг.
²Эмпирическая формула витамина – C₆₃H₈₈N₁₄O₁₄PCo. Пока структура не была установлена, ученые в исследованиях пользовались следующей приблизительной формулой: C_61–64H_86–92N₁₄O₁₄PCo.
³Метод изоморфного замещения является одним из важнейших методов в рентгеноструктурном анализе сложных органических молекул, в частности белков.
⁴ Томас Ходжкин был потомком знаменитого Т.Ходжкина, по имени которого рак лимфатической системы назван болезнью Ходжкина. Томас Л.Ходжкин впоследствии много лет являлся директором Института по изучению Африки при Ганском университете.